近日，上海交大校友、华盛顿大学生物医学专业博士生李海廓，以肾脏作为研究模型，利用高通量单细胞方法，揭示了全新的细胞代谢反应。

在肾脏纤维化过程中，针对细胞损伤修复反应、以及代谢调节机制，他进行了深入研究。借此构建出一个双模型、11 个疾病发展时间点、24 个样本、以及 30 多万个高质量单细胞的转录组图谱。

（来源：Cell Metabolism）

据介绍，此前研究往往局限于研究肾脏纤维化的某个具体时期，一般以疾病晚期模型为主。

而本次工作基于多个肾脏纤维化模型，构建了“全时间”尺度的单细胞转录组图谱。为该疾病在前中期的分子尺度变化、以及细胞层面变化，带来了更深刻的见解。

同时，本课题的主要发现在于：在缺血型肾脏损伤模型的前期，存在一种显著增强的上皮细胞脂肪代谢反应，而这种代谢通路是之前从未被发现的。

在肾脏损伤和纤维化领域，研究人员还首次提出了脂滴的重要性，这一发现颠覆了人们对肾脏疾病中脂肪代谢的传统认知。

此外，该团队构建的肾脏纤维化图谱，也给上皮细胞的分化应激反应、上皮-基质互相作用等研究，提供了高通量资源平台。

而且，对于激活型脂肪代谢通路、以及脂滴包被蛋白 2（perilipin2，PLIN2）的调控，也都是全新的发现。

在进一步的体外实验中，课题组对 PLIN2 进行了初步的遗传学敲落，发现了随之而来的能量代谢失调。至于该基因在体内的遗传调控机制、以及临床转化的靶点价值，有待进一步的探索。

另外，早期的激活型脂肪代谢，和临床病人的晚期疾病严重程度是否存在相关性？也是极具价值的后续研究方向。

图 | 李海廓（来源：李海廓）

被人忽视的慢性肾脏疾病

此次研究成果和慢性肾脏疾病息息相关。该类疾病其实就在我们身边，但却常常被大家忽视。

全球范围内，超过 10% 的成年人口患有不同程度的慢性肾脏疾病；在中国，患病人口据估计超过 1.2 亿，且这一比例极有可能随着人口老龄化进一步升高。

其发病因素众多，包括高血压、糖尿病、感染、毒素积累和复杂的遗传因素等。然而，无论发病原因是什么，肾脏纤维化——是该病的共有特征性通路。

作为一种慢性病，它在发病前期并没有显著的临床症状。因此，很多早期患者并不会意识到自己患病。但是，一旦进展到晚期（终末期肾病），则会导致肾功能衰竭。

目前，针对终末期肾病患者，除了肾透析或肾移植之外，全世界范围内仍未出现公认的有效治疗方案。

所以，此次课题的主要目标在于，利用小鼠肾脏损伤和纤维化模型，探索疾病前中期的细胞损伤修复反应、以及代谢水平的变化，助力人们理解该疾病从前期到晚期的发展过程，并致力于发现可用于早期诊断和治疗的潜在医疗靶点。

因此，摆在该团队面前的任务之一是：如何同时挖掘多模型、多时期、多样本的肾脏细胞基因的表达形态？

这时，得先解决一些技术性难题：

难题一是，在传统单细胞测序技术中，通常只能对单样本、在单个实验中进行测序，若进行多样本标记，则受限于细胞通量；

难题二是，假如进行多个实验分析、并进行大数据合并，则受限于批次效应的算法解决、以及高昂的单细胞文库构建成本。

因此，通过文献调研，该团队挑选了一个名为 sci-RNA-seq3 的新型单细胞转录组测序技术，它能在较低的预算范围内实现高通量、多样本的同时处理 [2，3]。

同时，他们对该技术进行了肾脏细胞特异性的方法优化，提升了方法的可重复性和基因检测灵敏度。

随后，课题组构建了文章开头提到的双模型、11 个疾病发展时间点、24 个样本、以及 30 多万个高质量单细胞的转录组图谱。

对于 11 个疾病时间点和 24 个样本，他们逐一进行深度的数据分析。值得注意的是，在构建缺血型急性肾脏损伤模型 6 小时之后（即模拟疾病发生后的 6 小时），该团队发现在近端小管上皮细胞中，出现了脂肪代谢相关基因的高表达，暗示存在着上调的脂肪代谢细胞活性。

这一发现是出乎意料的，因为之前有研究发现在慢性肾脏疾病的晚期，存在下调、被抑制的脂肪代谢通路 [4]。而在肾病早期，该通路的形态从未被系统性阐述过。

因此在这篇论文中，课题组首次报道了这一内容：即脂肪代谢通路会在疾病发生约 6 小时后短暂地上调激活，包括脂肪酸氧化、脂质聚集和水解等相关基因的表达上调。而当疾病进展到中晚期，这种“激活”形态会呈现出“被抑制”的通路活性。

接着，对于肾脏纤维化过程中的脂肪聚集，研究团队进行了定性分析和定量分析，借此验证了这一规律：在 6 小时的时间点中，存在显著的上皮细胞脂肪积累。而这些聚集的脂肪（以甘油三酯为主），会在 1-2 天后基本消失。

同时，对人体肾脏上皮细胞进行体外脂肪酸处理之后，他们还验证了如下规律：在肾脏纤维化过程中，脂肪酸氧化会被被激活、并能发挥脂肪代谢的作用。

（来源：Cell Metabolism）

除此之外，课题组还探索了脂肪积累事件的分子层面的特征，并提出了下述猜想：这种迅速的脂肪积累，极有可能伴随着脂滴的形成。

脂滴，是一种存储脂质的细胞器结构，它的合成必然会调动脂滴表面蛋白的基因表达。

基于此，结合单细胞转录组、以及空间转录组数据，课题组又揭开了一个新知识的“面纱”：在肾脏近端的小管上皮细胞中，PLIN2 是重要的脂滴标记物，PLIN2 基因能在脂肪聚集的 6 小时内，提升超过 10 倍的表达量，继而助力于脂滴的形成、以及能量代谢稳态的调控。

（来源：Cell Metabolism）

近日，相关论文以《全面的单细胞转录谱定义了肾纤维化过程中共有和独特的上皮损伤反应》（Comprehensive single-cell transcriptional profiling defines shared and unique epithelial injury responses during kidney fibrosis）为题发表在Cell Metabolism 上（IF 31.4）。

图 | 相关论文（来源：Cell Metabolism）

李海廓是第一作者，全球知名肾脏疾病和纤维化专家、华盛顿大学医学院教授本杰明·汉弗莱斯（Benjamin Humphreys）担任通讯作者 [1]。

“杂志编辑和审稿人对我们的方法学创新（即对 sci-RNA-seq3 的应用）、数据库的重要性（即超过 30 万个细胞的转录组图谱）和科学发现（即全新的脂肪代谢在肾病中的调节机理）均给予积极评价。

审稿人也提出了一些建议，比如观测线粒体形态在脂肪聚集过程中的变化、以及氧气利用率在脂肪酸氧化中的动态调整，我们在此深表感谢，”李海廓说。

“一个从未被报道过的全新发现”

据介绍，在肾脏纤维化中，对于上皮细胞的去分化/再分化的损伤修复机制、上皮-基质互相作用、以及基因组技术在疾病中的应用，汉弗莱斯教授具备深厚的经验 [5]。

而此次应用的单细胞转录组测序技术 sci-RNA-seq3 的最初版本，由华盛顿大学医学院基因组科学系教授杰伊·施耐德（Jay Shendure）课题组的曹俊越博士等人提出 [2]。

在此版本的基础上，该团队对其进行特异性优化，借此构建了高通量的肾脏纤维化转录组图谱。

再如，脂肪代谢在晚期慢性肾脏疾病中的表型，曾被宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院教授凯塔琳·苏斯塔克（Katalin Susztak）等课题组报道过 [4]。这些前人的科学发现，给此次研究带来了启发。

“我作为博士研究生加入 Humphreys 课题组时，表达了对于单细胞技术疾病应用和临床转化的强烈兴趣。

因此，当 Humphreys 向我介绍 sci-RNA-seq3 这个全新技术时，我们一拍即合，决定首先开展该技术在肾脏中的特异性优化的研究，”李海廓表示。

而这篇论文的作者数量极少，这在湿实验和干实验的紧密结合型论文中，是比较罕见的。其中，湿实验以分子生物学和生物化学实验为主，干实验以生物信息学&代码编写和数据处理为主。

对此他表示：“主要因为导师Humphreys 鼓励我同时加强湿实验和干实验的科研训练，他认为未来的科学家应同时具备这两种能力，才能将大数据科学中的统计发现，更有效率地转化为生物理论模型的构建。而此次我也深切意识到了湿实验、干实验二者的相辅相成和紧密联系。”

同时，最让李海廓感到激动人心的时刻，莫过于发现了肾脏损伤 6 小时后脂肪迅速积累的时刻。

当时，他在数据分析中发现了不寻常的脂肪酸代谢的基因表达。“直觉告诉我：我应该利用生物化学方法，去观察一下不同疾病阶段的脂肪含量。于是，我对包括缺血型肾脏损伤 6 小时在内的、多个时间点的小鼠肾脏组织切片，进行了脂肪染色。然后，带着切片跑去显微镜房进行观察拍摄，”他说。

当看到在 6 小时的时间点内，令人意料地出现大量脂肪积累时，在漆黑的显微镜房内，他忍不住多次“哇哦”。那一刻，李海廓意识到这是一个从未被报道过的全新发现。

（来源：Cell Metabolism）

事实上，对于单细胞技术等新型组学方法、在疾病和发育中的应用，李海廓有着强烈的科研热情。

在上海交大读大学时，他加入了致远学院和致远荣誉计划，这是一个注重基础学科培养的拔尖实验基地。本科期间，李海廓曾多次进行海外交流学习。之后，来到华盛顿大学读博。

此次论文便是其读博期间的成果之一，而类似的研究方法，也能用于研究其他组织器官。其表示：“我渴望在未来通过更丰富的多组学技术方法，去回答交叉领域的生物问题。也希望能在未来某个时刻回国。上海交大的校训是‘饮水思源，爱国荣校’，这对我的影响很大，因此我期待能将自身所学，贡献到社会发展中。”

参考资料：

1.Li, Haikuo, et al. "Comprehensive single-cell transcriptional profiling defines shared and unique epithelial injury responses during kidney fibrosis."Cell Metabolism (2022).

2.Cao, Junyue, et al. "The single-cell transcriptional landscape of mammalian organogenesis."Nature 566.7745 (2019): 496-502.

3.Li, Haikuo, and Benjamin D. Humphreys. "Single cell technologies: Beyond microfluidics."Kidney360 2.7 (2021): 1196.

4.Kang, Hyun Mi, et al. "Defective fatty acid oxidation in renal tubular epithelial cells has a key role in kidney fibrosis development."Nature medicine 21.1 (2015): 37-46.

5.Humphreys, Benjamin D. "Mechanisms of renal fibrosis."Annual review of physiology 80 (2018): 309-326.